技術(shù)專題

磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析簡(jiǎn)介

免疫診斷的發(fā)展歷史[建議把免疫診斷發(fā)展史放在文章開頭，專題的邏輯可以如下：
免疫學(xué)發(fā)展史——化學(xué)發(fā)光技術(shù)——化學(xué)發(fā)光免疫分析——磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析]
免疫學(xué)的發(fā)展史起始于微生物學(xué)研究，于18世紀(jì)建立，19 世紀(jì)至 20 世紀(jì)中期進(jìn)入經(jīng)典發(fā)展期。這一時(shí)期，人們對(duì)免疫功能的認(rèn)識(shí)由人體現(xiàn)象的觀察進(jìn)入了科學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)期。20世紀(jì)初期到中期，進(jìn)入近代免疫學(xué)時(shí)期。從20世紀(jì)中期開始，真正進(jìn)入現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期?，F(xiàn)代免疫學(xué)的檢測(cè)基本歷經(jīng)了以下幾個(gè)過程，如圖1所示。

圖1.免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展史

免疫學(xué)檢測(cè)主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。各類免疫學(xué)檢測(cè)方法的性質(zhì)及發(fā)展?fàn)顩r詳見表格1。免疫診斷在臨床診斷中占據(jù)著非常重要的地位，但是從我國(guó)臨床免疫診斷現(xiàn)狀來(lái)看，其步伐都落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，亟待改進(jìn)。

表1. 各類免疫檢測(cè)技術(shù)的性質(zhì)及優(yōu)缺點(diǎn)

化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種測(cè)定方式。該技術(shù)的原理是利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì)釋放等能級(jí)的光子，對(duì)光子進(jìn)行測(cè)定而進(jìn)行定量分析（見圖2）。化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。

圖2. 化學(xué)發(fā)光基本原理示意圖

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用CLIA測(cè)定。CLIA起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代具備以下特點(diǎn) ：
①高度敏感，極限達(dá)10-17－10-19mol/L，遠(yuǎn)高于放射性免疫（RIA）、酶聯(lián)免疫（EIA）。與時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當(dāng)，但比TRFIA便宜。
②特異性強(qiáng)，重復(fù)性好CV＜10％。
③測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。
④試劑穩(wěn)定性好，無(wú)污染有效期12月。
⑤操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。
磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來(lái)的一種新興分析方法，其基本原理見圖3 。該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動(dòng)化性，化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)了不可替代的作用。

圖3. 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)（雙抗夾心法）原理示意圖

目前磁微?；瘜W(xué)分析免疫分析已經(jīng)應(yīng)用于管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目以及電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目。

能夠用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的磁珠種類

按材質(zhì)分：

按照官能團(tuán)分：

海貍磁珠應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)機(jī)理

磁珠用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的方法

間接法

間接法就是包被抗原，然后用酶標(biāo)記的抗抗體檢測(cè)樣本中抗體，基本原理見圖4，適合于檢測(cè)對(duì)象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)較方便，只要變換包被抗原就可以檢測(cè)不同的項(xiàng)目。間接法的缺點(diǎn)：標(biāo)本中的特異性抗體會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗原，使結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

圖4. 采用間接法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標(biāo)抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標(biāo)抗抗體孵育，清洗。
d)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。

捕獲法

血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定，因此測(cè)定IgM抗體多用捕獲法。基本原理如圖5所示，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測(cè)定特異性IgM。

圖5. 采用捕獲法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標(biāo)本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合洗滌。
d)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合洗滌。
e)加底物顯色，檢測(cè)信號(hào)。

固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法，是指受檢抗體和酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)性的與磁珠表面抗原結(jié)合。固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法基本原理如圖6所示。結(jié)合于固相載體的酶標(biāo)抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無(wú)抗體，酶標(biāo)抗體能夠順利與抗原結(jié)合，出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。若受檢樣本中有抗體，則競(jìng)爭(zhēng)性的占去了酶標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合，酶標(biāo)抗體的結(jié)合力減弱，信號(hào)強(qiáng)度減弱。

圖6. 采用固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原的混合液孵育。
c)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。

雙抗夾心（兩步法）

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，基本原理如圖7所示。

圖7. 采用雙抗夾心法（兩步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟：

a)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜。
b)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)問，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
c)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。
d)加發(fā)光底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

雙抗夾心法（一步法）

在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hook effect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果（如圖8， 雙抗夾心法及雙位點(diǎn)一步法。缺點(diǎn)：假陰性）

圖8. 采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

圖9. 采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，當(dāng)樣本中抗原量較多是，容易出現(xiàn)假陰性。

操作步驟：

a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標(biāo)二抗孵育，清洗。
c)加發(fā)光底物，檢測(cè)信號(hào)。

海貍產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

領(lǐng)先的表面技術(shù)

蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司，掌握先進(jìn)的生物納米表面技術(shù)，能夠保證蛋白的覆蓋率、有效控制蛋白質(zhì)的定向包被、充分表露蛋白的活性位點(diǎn)。生物納米表面技術(shù)成功將生物技術(shù)與納米技術(shù)融合，明顯改善一些生物材料表面的非特異性吸附現(xiàn)象。通過近4年的技術(shù)沉淀，已經(jīng)申請(qǐng)相應(yīng)專利12篇。

海貍公司生物納米表面技術(shù)，能夠保證蛋白的定向性，以及活性位點(diǎn)的充分暴露。
左圖普通技術(shù)包被的磁珠，表面抗體呈現(xiàn)雜亂無(wú)章，保持5%-10%的抗體活性。
右圖海貍公司采用定向包被技術(shù)，保證抗體的活性端充分暴露，保持抗體100%的活性。

自主研發(fā)磁珠

作為國(guó)內(nèi)最大、種類最全的磁珠生產(chǎn)商之一，蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司以國(guó)際領(lǐng)先的生物納米表面技術(shù)和高效生物試劑技術(shù)為核心，開發(fā)了一系列生物醫(yī)用磁珠及試劑盒。其中，磁珠類產(chǎn)品線囊括了多個(gè)領(lǐng)域，包括特異性標(biāo)記與捕獲，蛋白快速分離與純化，核酸提取與文庫(kù)構(gòu)建，及高通量、自動(dòng)化生物樣本處理綜合技術(shù)平臺(tái)。目前，海貍公司已經(jīng)發(fā)展成為一家集自主研發(fā)、規(guī)模化生產(chǎn)和銷售服務(wù)于一體的生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域高科技企業(yè)。

海貍公司磁珠的微觀形貌

a）Mag COOH-2000掃描電鏡顯微鏡圖，該磁珠的粒徑分布均一，為2微米。表面光滑，能夠降低部分非特異性吸附。
b）Mag NH₂-500偶聯(lián)SA蛋白后的掃描電鏡顯微鏡圖片。采用海貍納米科技表面技術(shù)包被的SA磁珠能夠保證SA蛋白的均勻包被，且避免磁珠的粘連。
c）磁性瓊脂糖微球的顯微鏡成像圖片。采用納米級(jí)磁核，填充于30-150μm的瓊脂糖微球內(nèi)，形成載量極高的微球。對(duì)抗體的結(jié)合量達(dá)30mg/mL磁性微球。
d）將Magrose NHS磁珠偶聯(lián)熒光蛋白后，在熒光顯微鏡中成像圖片。該磁珠能夠促使蛋白均勻分布，且保證蛋白的利用效率。

定制服務(wù)

海貍公司憑借先進(jìn)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和豐富的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)建了高端研發(fā)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，可提供全面的生物研究試劑服務(wù)。

服務(wù)內(nèi)容：

1.磁珠偶聯(lián)蛋白；
2.磁珠偶聯(lián)多肽；
3.磁珠偶聯(lián)抗體；
4.磁珠與核酸相關(guān)偶聯(lián)等技術(shù)。

服務(wù)特色：

1.技術(shù)領(lǐng)先，經(jīng)驗(yàn)豐富、富有開創(chuàng)性的專業(yè)研發(fā)團(tuán)隊(duì)；
2.專業(yè)的項(xiàng)目管理人才，完善的項(xiàng)目管理系統(tǒng)；
3.量身打造的定制生產(chǎn)，幫助客戶降低資金和時(shí)間成本。

海貍磁珠（BeaverBeads?）在化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的應(yīng)用

可用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的磁珠，種類如前面第三章所列。但其中，鏈霉親和素磁珠的使用最為廣泛，主要是因?yàn)橛H和素-生物素系統(tǒng)的通用型以及廣泛性。親和素-生物素系統(tǒng)（BAS）的主要特點(diǎn)如下列表。

海貍鏈霉親和素磁珠，是采用蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程納米表面技術(shù)，將重組鏈霉親和素蛋白高密度定向包被到超順磁性微球表面，排列均勻，并朝向一致。產(chǎn)品具有較高的生物素結(jié)合效率和較低的蛋白及DNA非特異吸附。每mg磁珠的游離生物素結(jié)合量高達(dá)800pmol以上，生物素化抗體結(jié)合量為20μg以上。

海貍鏈霉親和素磁珠化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在配合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，體現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，以及與進(jìn)口品牌磁珠相當(dāng)?shù)撵`敏性。

檢測(cè)方法：雙抗夾心兩步法

結(jié)論

BeaverBeads^TMStreptavidin具有很好的穩(wěn)定性能，CV值控制在5%以內(nèi)與進(jìn)口磁珠相當(dāng)。
BeaverBeads^TMStreptavidin對(duì)非特異性具有良好的控制，S0明顯低于進(jìn)口磁珠。
BeaverBeads^TMStreptavidin的靈敏度較高，Ratio（S/0）比值控制在2.0，與進(jìn)口磁珠相當(dāng)。